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<title>Thesis (shiokawa)</title>

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<h2>２００８年度 修士論文要旨</h2>

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腸内連鎖球菌Na<sup>+</sup>-ATPaseの発現とその主サブユニットの精製・結晶化<p>

塩川明日香

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　イオン輸送性ATPaseは、細胞内イオン環境の恒常性維持に重要な役割を果たす膜

タンパク質の一群である。その一種であるV型ATPaseは、真核生物の細胞内酸性小胞

の酸性化などの重要な役割を担っている。しかし研究対象が真核生物に限られていた

ため分子生物学的、生化学的研究が遅れていた。<i>E.hirae</i>のNa<sup>+</sup>輸送性ATPaseは原核生

物で発見された初めてのV型ATPaseであり、本研究室ではその構造や機能に関する

研究が進められてきた。しかしながら<i>E.hirae</i>は<i>E.coli</i>と異なり遺伝子操作が難しく、

それは<i>E.hirae</i>由来V型ATPaseの研究の進展にとって障害となっていた。<p>

　この報告では、V型ATPaseの構造・機能解析を行うことを目的とし、<i>E.coli</i>で本

Na<sup>+</sup>輸送性V型ATPaseを発現・精製する系の構築と、主サブユニットの大量精製、

結晶化を行なった。まず、タグを付加したV型ATPase(V<sub>1</sub>V<sub>O</sub>)全体を得るため、発現ベ

クターのコンストラクトを検討した。<i>E. hirae</i>の遺伝子破壊株を用いた相補性試験

により、F, Kサブユニットにタグを付加したV型ATPaseでも発現・機能しうること

がわかった。コンストラクトを再検討した大腸菌用の発現ベクターを用いたところ、

Kサブユニットの発現は確認できたが、本ATPase全体の発現は確認できなかった。

ベクター構成のより詳細な検討が必要かもしれない。そこで個々のサブユニットの

発現を検討した。まず、触媒頭部部分を構成する主サブユニットであるA, B各サブ

ユニットの構造解析を目指し、大腸菌での大量発現・精製系を構築した。精製し

た各サブユニットの安定性をゲルろ過クロマトグラフィーで確認し、結晶化を行っ

た結果、Aサブユニットで結晶が得られる条件が見つかった。結晶化条件の精密化

により、Ｘ線構造解析に十分な良質な結晶を得ることが次の課題である。<p>

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