２０１０年度 修士論文要旨

tRNA特異的リボヌクレアーゼコリシンDによる大腸菌細胞応答の再検討

杉田　梨紗

　コリシンDは大腸菌のColDプラスミドが生産して，他の大腸菌に受容体経由で侵入し， 特定のtRNAを切断して細胞を殺す蛋白質毒素である。コリシンDの標的が生物間で普遍性 の高いtRNAであることに着目し，その活性ドメインを出芽酵母内で誘導的に発現させる と，tRNAArgが切断されて生育が止まる。面白いことにコリシンDは，基質 tRNAの切断感受性がほぼ同等であるにも関わらず，大腸菌に対して殺菌的に，酵母に対 しては静菌的に作用する。また，作用の似たコリシンE5によるtRNA切断を追跡すると， 未切断分子が相当量残っている場合でも死に至る。今までコリシンDが引き起こす大腸菌 の細胞死は，tRNA切断が原因だと唱えられてきた。しかし，前述した結果から私は， tRNA切断が直接殺菌を導くのではなく，tRNA切断からある過程を経て細胞死が引き起こ されることを想定した。そこで本研究では，コリシンDによるtRNA切断と生存数(コロニ ー形成数cfu)の相関を経時的に追跡することにより，細胞死の原因を改めて問うことを 目的とした。

　しかし，コリシンは細胞内に数分子侵入するだけで大腸菌は死ぬが，一旦侵入した 毒素は除いたり希釈したりできないので，コリシンはいつまで働き続けて菌を殺すのか 調べようがなかった。そこで，本研究では，活性ドメインの点変異により温度で活性の ON/OFFが可能な温度感受性(ts)コリシンを作製し，実験に利用した。

　tsコリシンを30℃で大腸菌に与えると，野生型(wt)コリシンと同様に15分以内に細胞 内のほとんどの感受性tRNAが切断される(前述のE5の場合とは状況が異なるかも知れな い)。しかし，約2時間に到るまでcfuは維持されており，42℃へ上げることで大腸菌の 生育が回復した。すなわち，大腸菌はtRNAを失うだけではすぐに死なず，tRNA切断が直接 細胞死を意味しないことが判った。さらに，tmRNA欠損株(ΔssrA)においても同様の実験 を行ったところ，コリシンに対する感受性が若干高まった。これらのことから，コリシ ンの大腸菌に対する殺菌作用は，生死を分ける真の細胞内要因は不明ながら，細胞死に 至るまでの間に，tRNA切断による細胞内障害を回復させる品質管理機構が関わっている 可能性が考えられた。

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