慢性関節リウマチモデルとしての
HTLV-Ⅰ遺伝子導入トランスジェニックマウス
岩倉 洋一郎
１． はじめに
１９８２年、ヒトのある種の白血病（成人Ｔ細胞白血病：ATL）が現在ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）とよばれるレトロウイルスによって引き起こされることが、当時京都大学ウイルス研究所にいた日沼らにより初めて明らかにされた［１］。日本には１００万人にも及ぶこのウイルスの感染者がおり、毎年、５００?７００人程度の白血病患者が発生することがわかっている。その後HIVがエイズの原因ウイルスであることが明らかにされ、レトロウイルスはヒトに対する非常に重要な病原ウイルスであることがわかっている［２］。 HTLVとHIVに共通していることは、宿主域が狭く、ヒト以外ではサルの他には通常感染しないことである。ワクチンや治療薬を開発するためには動物実験が欠かせないが、サルを用いた感染実験を行うことは現実には大変難しく、大きな障害となっている。宿主域バリアーの主なものは、ウイルスの吸着・侵入に必要なレセプター分子が他の動物にはないためであることが知られており、我々はウイルスの遺伝子を直接マウス受精卵の核に注入することにより、宿主域バリヤーを越え、これらウイルスの感染モデルを作ることを試みた。
レトロウイルスによる感染症のモデルとしてトランスジェニック（Tg）マウスを使うことには利点と同時に限界があることを指摘しておく必要がある。利点としては、サルを使う場合に較べ、遺伝学的、微生物学的によくコントロールされた実験が可能であること、動物の取り扱いが容易であること、経済的であること、動物愛護上の問題がより少ないことなどがあげられる。しかも、レトロウイルスは自然感染の場合にもウイルス遺伝子は宿主DNAに組み込まれた状態で遺伝子発現を行うことから、遺伝子発現の調節機構が自然感染時に近いことが特徴である。一方、Tgマウスでは垂直感染様式をとることから、通常の水平感染の場合とは異なる臓器に障害が発生することが起こり得る。また、このためウイルスに対する免疫応答は通常見られない。従って、ウイルスに対する免疫応答が病態形成に関与する場合は、病態を再現できない可能性がある。そのうえ、ウイルスレセプターがないために再感染が起こらず、感染の拡大を見ることができないなどの問題点がある。従って、Tgマウスを疾患モデルとして用いる場合には、実際の病気と比較して病態の異同をよく吟味し、モデルとしての有用性を検討することが重要である。このことはレトロウイルス以外の感染モデルについても同じである。
我々は、HTLVのうち日本人に感染者の多い、HTLV-Ⅰ遺伝子を導入したTgマウスを作製し、このマウスが関節リウマチのモデルとして有用であることを明らかにしたので紹介する。
２．関節リウマチ
慢性関節リウマチは関節病変を主徴とする全身の異常を伴った炎症性疾患で、自己免疫疾患の一つである［3］。患者は人種にかかわりなく、世界中に分布しており、人口の約1％、日本でも70万人程度の患者がいるとみられている。慢性関節リウマチの発症は、ＨＬＡ?ＤＲ４やＤＲ１など特定のクラスII組織適合抗原と相関することが知られており、特定の抗原の提示能が発症に関係している可能性が示唆されている。しかし、このような遺伝的な要因と共に、ウイルスや細菌、マイコプラズマなどの感染も発症要因になっていると考えられている。実際、マイコバクテリアや連鎖球菌などは動物に関節炎を起こす能力を持っていることが知られており、菌体成分の一部（ＨＳＰ６５やプロテオグリカン）が滑膜成分と免疫的に交叉するためであると考えられる。また、これらの細菌の持つスーパー抗原の関与も注目されている。
いくつかのウイルスについても関節炎を起こすことが知られている。風疹ウイルスに感染すると一過性に関節炎になる場合があり、他にＥＢウイルスやパルボウイルス、TTウイルスなどと関節リウマチとの関連も指摘されている。これに関し、ＥＢウイルスやアデノウイルスなどの構成蛋白の一部がＤＲβ鎖がコードするアミノ酸配列の一部と相同性を持つことが知られている。後で詳しく述べるように、我々はＨＴＬＶ?１が慢性関節炎を引き起こすことを発見したが、他のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）やHIVなどのレトロウイルスも関節炎を引き起こすことが知られている。これらのウイルスはいずれも免疫異常を引き起こすことが知られている。
いずれの原因にしろ、関節構成成分に対する自己免疫応答の結果、関節で炎症が引き起こされる。このとき、免疫応答、あるいは感染に伴う自然免疫応答の結果として産生されるサイトカインが病態形成に重要な役割を果たすのではないかと考えられている。また、炎症応答はRANKL/ODFの発現を促し、破骨細胞を活性化して、骨破壊を引き起こすと考えられている。
３． HTLV-Ⅰ-tax遺伝子導入Tgマウス
HTLV-Ⅰの遺伝子構造は他のレトロウイルスと同じく、両端に転写調節機能を持つLTRが存在し、構造遺伝子として、gag、pol、env遺伝子を持つ。他にpX領域には、遺伝子発現調節に関与すると考えられる、tax、rex、p21遺伝子が存在する（図１）。このうちtaxは転写促進因子であり、ウイルス自身の転写を活性化する他、宿主のCREB結合エンハンサー、NFkB結合エンハンサー、Serum Responsive Element などを活性化して転写を促進することが知られている［4］。これらの遺伝子にはIL-2レセプターや、IL-1、c-fosなど、免疫応答や細胞増殖に重要な遺伝子が含まれていることから、このウイルスの病原性にはtaxが関与することが示唆されている。そこで、我々はtaxを導入したTgマウスを作製し、その病原性を検討した。最初、env-pX領域を導入したマウス（HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウス）を作製し、関節炎が発症することを発見した［5］が、その後tax遺伝子のみを導入したものを作製し、同じく関節炎を発症することを見いだし、taxが原因であることを確認した（図１）［6］。プロモーターとしてLTRの他に、T細胞特異的なCD4プロモーターやマクロファージ特異的なfmsプロモーターを用いても同様の関節炎を発症することを認めている。
図1：導入遺伝子の構造
最上段にHTLV-Ⅰの遺伝子構造とその遺伝子産物を、中段にはHTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスの導入遺伝子とその産物、下段にはHTLV-Ⅰ-tax-Tgマウスの導入遺伝子の構造とその産物を示す。
HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスにおける関節炎は２ヶ月齢を過ぎる頃から認められ、複数の関節が侵されたが後肢の足根関節の肥大が最も顕著であった。病理的には関節滑膜細胞の増殖が顕著で、滑膜細胞や周辺組織への炎症性細胞の浸潤、骨、軟骨の破壊、肉芽組織による骨の置換（パンヌスの形成）が認められた（図２）[7]。血清学的には血中の免疫グロブリン量が増加しており、免疫グロブリンや、関節の構成成分である２型コラーゲン、熱ショックタンパク質などに対する自己抗体価が上昇していた[8]。また、免疫グロブリンのアスパラギン結合型糖鎖の末端のガラクトース含量が低いことがわかった[9]。これらの所見はヒトの関節リウマチと非常によく似ており、HTLV-Ⅰがヒトの関節リウマチの原因になっていることを示唆するものであった。その後、長崎大学の江口らは九州地方で疫学調査を行い、予想通りこのウイルスが関節リウマチの原因の一つになっている可能性が高いことを示している[10]。これは、トランスジェニックマウスを作製することにより、ある遺伝子の特定の病気への関与が明らかになった一つの例である。
図2：関節の病理像
Ａ：滑膜の増殖。Ｂ：骨表面に沿った滑膜の増殖、骨の浸食。炎症性細胞の浸潤。Ｃ：関節腔への好中球の浸潤、組織への炎症性細胞の浸潤。Ｄ：破骨細胞による骨の破壊、肉芽様組織による置換、炎症性細胞の浸潤、パンヌスの形成。
HTLV-Ⅰは成人Ｔ細胞白血病の原因ウイルスとして知られているが、これらのマウスに白血病は認められなかった。しかし、これらのマウスには12ヶ月齢以上になると繊維肉腫や神経繊維腫のような間葉系の癌が多発した[11]。癌組織およびそれが由来した正常組織では、c-fosおよびc-jun遺伝子発現の亢進が認められ、発癌との関連が示唆された。
関節炎の発症機構を解析するために、HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスをヌードマウスと掛け合わせたところ、発症率が非常に低くなることを見出した（表１）[12]。この結果は、Ｔ細胞が発症に重要な役割を果たしていることを示している。また、Tgマウスの骨髄細胞を放射線照射した野生型マウスに移植したところ、関節炎を発症した[12]。逆に、野生型マウスの骨髄細胞をTgマウスに移植すると、関節炎の発症は完全に抑制された。これら結果は骨髄由来の幹細胞の異常が関節炎の原因であることを示しており、自己免疫が関節炎の発症に関与していることを強く示唆する。また、関節炎の治療に骨髄移植が有効であることを示唆している。
関節炎の発症率はマウスの遺伝背景により、大きく異なる。C3H/Heの場合３ヶ月齢で約20％、６ヶ月齢で40％であったが、BALB/cでは３ヶ月齢ですでに６０％も発症しており、6ヶ月齢では80％であった。反対にC57BL/6ではほとんど発症が認められなかった（表１）[13]。この結果は、関節炎の発症がtax以外の宿主遺伝子によって影響を受けていることを示している。人でも関節炎の発症には１０個以上の遺伝子が関与していることが知られており、今後発症率に関与する背景遺伝子の同定が重要な課題である。
自己免疫の発症機構として、胸腺におけるネガティブセレクションの異常が疑われた。しかし、末梢のTCRＶβ鎖のレパートリーは正常であり、内在性MuLVによるクローン除去も正常に認められた[14]。一方、関節ではＴ細胞のオリゴクローナルな増殖が見られ、その一部は２型コラーゲンに対する反応性を示した。従って、このマウスでは末梢での免疫寛容が破綻しており、関節で自己反応性のＴ細胞が増殖しているものと考えられた。
興味深いことに、HTLV-Ⅰ-pX-TgマウスのＴ細胞はFas刺激によるアポトーシス感受性が大きく低下していることがわかった［15］。通常抗原刺激により活性化したＴ細胞は、Fasを介するメカニズムによってアポトーシスを起こすことが知られており、この結果はTgマウスではこの経路がうまく機能しないために、ネガティブセレクションを逃れて末梢に出てきた自己反応性のＴ細胞が関節内の自己抗原と反応することにより、異常に増幅・蓄積している可能性を示唆する。実際、HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスをfasに変異を持つMRL/lprマウスと掛け合わせると関節炎の発症率が高くなり、逆にfasを過剰発現するTgマウスと掛け合わせると発症率が下がることから、Ｔ細胞のアポトーシス感受性が関節炎発症に重要な役割を果たしていることがわかった［13］。
４． 関節炎発症におけるサイトカインの役割
HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスの関節ではIL-1、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインが強く発現していた［8］。同様のサイトカインの異常発現はリウマチ患者でも見られている。病態形成におけるサイトカインの役割を明らかにするために、HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスを種々のサイトカインノックアウトマウスと掛け合わせ、発症率を比較した［16］。その結果、野生型の発症率が３ヶ月齢で６０%、６ヶ月齢で８０%であったのに対し、IL-6を欠損させると３ヶ月齢頃まで全く発症が見られず、６ヶ月齢でも１０%程度であった。IL-1欠損の場合も発症率が大きく下がり、３ヶ月齢で１０%、６ヶ月齢で３０%程度であった（図３）。この結果は、これらのサイトカインが病態形成に重要な役割を果たしていることを示している。一方、ヒトの関節リウマチで重要な役割を果たしていることが知られているTNF-αは、このモデルでは欠損させても発症に影響を及ぼさなかった。これは、TNF-αの下流にあると考えられている、IL-1やIL-6がTaxによって直接誘導されるためであると考えられる。ヒトの場合も、３０〜４０％の患者には、抗TNF-αの効果が認められないとされており、同様に、下流のサイトカインが直接誘導されるメカニズムが働いている可能性がある。Th1/Th2バランスに影響を与えると考えられる、IFN-γ、IL-4などの欠損は発症率に有意な変化をもたらさなかった。
図３:発症率の比較
IL-1作用は内在性のアンタゴニストである、IL-1レセプターアンタゴニスト(Ra）によってコントロールされていることが知られている。最近我々はIL-1RaKOマウスを作製し、このマウスが関節炎を発症することを見いだした［17］。このマウスはHTLV-Ⅰ-pX-Tg同様、自己免疫になっており、関節の病理も関節リウマチにきわめてよく似たものであった。従ってこの結果は、関節で過剰発現しているIL-1などのサイトカインは、必ずしも炎症の結果ではなく、むしろ自己免疫の原因になりうることを示している。
最近我々はIL-1がＴ細胞に作用し、CD40リガンドやOX40などのコシグナル分子の発現を誘導することを見いだした [18] 。感染時や抗原刺激を受けたとき、抗原提示細胞はIL-1を産生し、そのIL-1がＴ細胞を活性化して、免疫系が活性化されるものと考えられる。自然免疫応答の結果産生されるサイトカインをメディエーターとして、獲得免疫系が活性化されることは、きわめて合目的的である。従って、taxなどの作用によってIL-1が持続的に産生されるような条件や、IL-1Raが欠損してIL-1シグナルが強く入る条件ではＴ細胞が過剰に活性化すると考えられる。このため、これらのマウスは自己免疫になるのであろう。これに関連して、HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスを２型コラーゲンで免疫すると通常は関節炎を発症しないC3H系統でも関節炎を発症することがわかっている[8] 。免疫系が極めて過敏な状態になっていることがわかる。実際、HTLV-Ⅰ-pX-TgではCD40LやOX40の発現が亢進しており、IL-1を欠損させると発現が正常化することがわかった［16］。従って、HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスにおける関節炎は、Taxの直接作用により関節滑膜でIL-1などのサイトカインの発現が誘導されるため、Ｔ細胞が過度に活性化され、関節構成成分に対する免疫応答が起こることが炎症の引き金になると考えられる（図４）。その結果さらに多くのサイトカインが産生され、ますます炎症を拡大すると共に、活性化Ｔ細胞上のRANKL/ODFが破骨細胞を活性化して骨破壊を招く。Ｔ細胞アポトーシスとの関連はまだわかっていないが、その異常にサイトカインが関係している可能性もあると考えている。
図４:HTLV-I-pX-Tgマウスの関節炎発症機構
滑膜細胞に組み込まれたtaxの作用により、炎症性サイトカインの過剰産生がおこる。これらのサイトカインはＴ、Ｂ、ＡＰＣをそれぞれ活性化し自己免疫を誘導する。自己免疫応答の結果、炎症が誘発されるとともに、RANKL/ODFの作用により破骨細胞が活性化され、骨が破壊される。
５． HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスの疾患モデルとしての有用性
HTLV-Ⅰ-pX-Tgは関節リウマチのモデルとして、抗リウマチ薬のスクリーニング・検定に有用である。ことに、遺伝子導入に用いたウイルスがヒトに関節リウマチを引き起こすことが特徴であり、ヒトの発症機構をよく反映しているのではないかと考えている。また、自然発症することはコラーゲン誘導関節炎やアジュバンド関節炎にはない特徴であり、これらのモデルでは発症の初期過程が再現できないのに対し、本モデルはその様な初期過程に作用する薬剤のスクリーニング系としても有用であろう。実際この系を利用して、様々な薬物の他、抗Fas抗体の効果、骨髄移植の効果、サイトカイン欠損の効果などが調べられている［12, 16, 19］。
本稿で紹介したBALB/c背景のHTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスの場合、発症率が３ヶ月齢で60％、６ヶ月齢で80％とやや低いが、最近作製した、fmsエンハンサー/プロモーターの下流にtaxを結合した遺伝子のTgマウスの場合は、２ヶ月齢で発症率が100％と極めて高くなっている(羽生ら、未発表）。従って、このマウスは実験を行う上でさらに便利になっている。
HTLV-Ⅰは関節炎のほか、慢性脊髄炎（HAM）やシェーグレン症候群など自己免疫の関与が疑われる疾患にも関与していると考えられている。実際HTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスも唾液腺への炎症性細胞の浸潤が認められている。この他、このマウスには肺へのリンパ球浸潤が認められ、ヒトHTLV-Ⅰ感染者に認められる肺病変との関連が注目される［20］。HAM関連の病変は認められていない。このようにHTLV-Ⅰ-pX-Tgマウスは関節炎以外のHTLV-Ⅰ誘導病変の解析にも有用であると考えられる。
参考文献
1. Sugamura, K., and Hinuma, Y.: Human retroviruses:HTLV-Ⅰ and HTLV-ⅠI. In"The Retroviridae", vol. 2, ed. J. A. Levy, Plenum Press, New York, 1993, 399-435.
2. Levy, J. A.: Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. Microbiol. Reviews 1993, 57:183-289.
3. Firestein, G. S. and Zvaifler N. J. Rheumatoid arthritis: A disease of disordered immunity. In "Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates", (J. I. Gallin, I. M. Goldstein, and R. Snyderman eds.), Raven Press, 1992, 959-975.
4. Yoshida M. HTLV-Ⅰ tax: regulation of gene expression and disease. Trends in Microbiol 1993, 1: 131-135.
5. Iwakura, Y., Tosu, M., Yoshida, E., Takiguchi, M., Sato, K., Kitajima, I., Nishioka, K., Yamamoto, K., Takeda, T., Hatanaka, M., Yamamoto, H., and Sekiguchi, T.: Induction of inflammatory arthropathy resembling rheumatoid arthritis in mice transgenic for HTLV-Ⅰ. Science, 1991, 253:1026-1028.
6. Habu, K., Nakayama-Yamada, J., Asano, M., Saijo, S., Itagaki, K., Horai, R., Yamamoto, H., Sekiguchi, T., Nosaka, T., Hatanaka, M., and Iwakura, Y.: The HTLV-Ⅰ-tax gene is responsible for the development of both inflammatory polyarthropathy resembling rheumatoid arthritis and non-inflammatory ankylotic arthropathy in transgenic mice. J. Immunol., 1999, 162:2956-2963.
7. Yamamoto, H., Sekiguchi, T., and Iwakura, Y. Polyarthritis in mice transgenic for human T-cell leukemia virus Type-Ⅰ (HTLV-Ⅰ). I. Histopathological characteristics of joints. Arth. Rheum., 1993, 36:1612-1620.
8. Iwakura, Y., Saijo, S., Kioka, Y., Nakayama-Yamada, J., Itagaki, K., Tosu, M., Asano, M., Kanai, Y., and Kakimoto, K.: Autoimmunity induction by human T-cell leukemia virus type I in transgenic mice that develop chronic inflammatory arthropathy resembling rheumatoid arthritis in humans. J. Immunol., 1995, 155:1588-1598.
9. Endo, T., Iwakura, Y., and Kobata, A. Structural changes in the N-linked sugar chains of serum immunoglobulin G of HTLV-Ⅰ-trans-genic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 192:1004-1010.
10. Eguchi K et al: High seroprevalence of anti-HTLV-Ⅰ antibody in rheumatoid arithritis. Arthritis Rheum, 1996, 39:463-466.
11. Iwakura, Y., Tosu, M., Yoshida, E., Saijo, S., Nakayama, J., Itagaki, K., Asano, M., Siomi, H., Hatanaka, M., Takeda, T., Nunoya, T., Ueda, S., and Shibuta, H.: Augmentation of c-fos and c-jun expression in tumors in transgenic mice carrying the human T-cell leukemia virus type 1 tax gene. Virus Gene, 1994, 9:161-170.
12. Saijo, S., Kotani, M., Habu, K., Ishitsuka, C., Yamamoto, H., Sekiguchi, T. and. Iwakura, Y.: Bone marrow derived cells are responsible for the development of autoimmune arthritis in HTLV-Ⅰ transgenic mice and those of normal mice can suppress the disease. J. Immunol., 1999, 163:5700-5707.
13. Iwakura, Y., Habu, K., Kotani, M., Horai, R., Asano, M., Tagawa, Y., Ishitsuka, C., and Saijo, S.: The development of autoimmune inflammatory arthropathy in mice transgenic for the HTLV-Ⅰ env-pX region is not dependent on H-2 haplotypes and modified by the expression levels of Fas antigen. J. Immunol., 1998, 161:6592-6598.
14. Kotani, M., Tagawa, Y., and Iwakura, Y. Involvement of autoimmunity against type II collagen in the development of arthritis in mice transgenic for the human T cell leukemia virus type I tax gene. Eur. J. Immunol., 1999, 29:54-64.
15. Kishi, S., Saijo, S., Arai, M., Karasawa, S., Ueda, S., Kannagi, M., Iwakura, Y., Fujii, M., and Yonehara, S.: Resistance to Fas-mediated apoptosis of peripheral T cells in human T lymphocyte virus type I (HTLV-Ⅰ) transgenic mice with autoimmune arthropathy. J. Exp. Med., 1997, 186:57-64.
16. Saijo, S., Asano, M., Horai, R., Yamamoto, H., and Iwakura, Y. Suppression of autoimmune arthritis in IL-1-deficient mice in which T cell activation is impaired due to low levels of CD40L and OX40 expression on T cells. Arth. Rheum., in press
17. Horai, R., Saijo, S., Tanioka, H., Nakae, S., Sudo, K., Okahara, A., Ikuse, T., Asano, M., and Iwakura, Y.: Development of chronic inflammatory arthropathy resembling rheumatoid arthritis in IL-1 receptor antagonist-deficient mice. J. Exp. Med., 2000, 191:313-320.
18. Nakae, S., Asano, M., Horai, R., Sakaguchi, N., and Iwakura, Y.: IL-1 enhances T cell-dependent antibody production through induction of CD40L and OX40 on T cells. J. Immunol., 2001, 167:90-97.
19. Fujisawa, K., Asahara, H., Okamoto, K., Aono, H., Hasunuma, T., Kobata, T., Iwakura, Y., Yonehara, S., Sumida, T., and Nishioka, K. Therapeutic effect of the anti-Fas antibody on arthritis in HTLV-Ⅰ tax transgenic mice. J. Clin. Invest., 1996, 98: 271-278.
20. Miyazato, A., Kawakami, K., Iwakura, Y., et al.: Chemokine synthesis and cellular inflammatory changes in lungs of mice bearing p40tax of human T-lymphotropic virus type 1. Clin. Exp. Immunol., 2000, 120:113-124.